Praktikum 7. (Woche 19.-23. Okt. 2020)

Immunserologie

 

Allgemeine Informationen:

Wir haben den theoretischen Hintergrund zur Immunserologie im Praktikum 5 ausführlich diskutiert. Deshalb werden wir diese Informationen nicht wiederholen, bitte nutzen Sie die Folien des Praktikums der 5. Woche für Vorbereitung auf das kommende Praktikum. Die Dozenten von jeder Gruppe helfen bei diesem Praktikum und koordinieren die Arbeit, aber werden nicht den Stoff des Praktikums der 5. Woche wiederholen. Jeder Student muss vorbereitet kommen, so dass er/sie das folgende Praktikum selbstständig durchführen kann.

In den ersten 10 Minuten gibt es den Vorlesungtest auf Medtraining, diesen können Sie mit ihren Mobilgeräten beantworten. Am Ende des Praktikums gibt es dieses Mal keinen Praktikumstest in Medtraining.

 

Arbeitsschritte des Praktikums:

I. Indirekter ELISA

In dieser praktischen Beschreibung können Sie die Schritte des heutigen Praktikums sehen. Heute machen wir einen ELISA-Test. Auf jedem Tisch befindet sich ein ELISA-Kit. Ziehen Sie sich einen Laborkittel und Gummihandschuhe an.

  1. Der erste Schritt ist die Sensibilisierung, bei der das Antigen an die Oberfläche der Mikrotiterplatten gebunden wird.
  2. Der zweite Schritt ist die Blockierung, wobei unspezifische Bindungsstellen mit Gelatine blockiert werden. Diese beiden Schritte wurden vom Hersteller durchgeführt.
  3. Der nächste Schritt ist das Hinzufügen von den zu untersuchenden Testproben und Standardkontrollen. Für die Demonstration arbeiten Sie nur mit den Standards (Calibrators).Die Mikrotiterplatte besteht aus einem Rahmen und einführbaren Streifen. Wir können so viele Streifen in den Rahmen passen, wie wir Proben haben. Die Kisten enthalten Flaschen mit der Aufschrift „Calibrator“. Die mit Calibrator gekennzeichneten Flaschen enthalten die antigenspezifischen humanen Antikörper  in einer bekannten Konzentration. „Calibrator A“ ist der am wenigsten konzentrierte Standard, „Calibrator F“ ist der höchste Standard. Das Kit enthält negative und positive Kontrollen sowie Gebrauchsanweisungen. Die Position der Löcher in den Streifen kann durch die Buchstaben und Zahlen auf dem Rahmen bestimmt werden. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Calibrator A ins Loch A1. Pipettieren Sie die anderen Calibratoren in die Löcher B1, C1 usw., und die positive Kontrolle ins Loch G1 und die negative Kontrolle ins Loch H1. Es folgt eine 30-minütige Inkubation. Während dieser Zeit machen Sie die Agglutination (sehe unten II.).
  1. Waschen: Gießen Sie die Flüssigkeit mit einer Bewegung in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Platte gegen das Papiertuch. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in die Löcher. Gießen Sie dann den Puffer in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Mikrotiterplatte einmal auf das Papiertuch. Wiederholen Sie das Waschen dreimal.
  2. Pipettieren Sie jetzt 100 Mikroliter Enzymkonjugatlösung (enthält Peroxidase konjugierte anti-human IgG Antikörper) in die Löcher. Es folgt eine 15-minütige Inkubation.
  3. Waschen: Gießen Sie die Flüssigkeit mit einer Bewegung in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Platte gegen das Papiertuch. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in die Löcher. Gießen Sie dann den Puffer in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Mikrotiterplatte einmal auf das Papiertuch. Wiederholen Sie das Waschen dreimal.
  4. Pipettieren Sie 100 Mikroliter TMB Substrat in die Löcher. Sie sollten die Farbreaktion innerhalb von 5 Minuten sehen. Die Negativkontrolle sollte farblos sein, wenn der Test korrekt durchgeführt wurde. Die Farbintensität der Standards ist proportional zur Konzentration des Antigens. Stoppen Sie nach 5 Minuten die Reaktion mit 100 Mikrolitern „STOP“-Lösung. Wegen der STOP-Lösung wird die blaue Lösung gelb. Die ELISA-Platte kann dann in einer ELISA-Lesemaschine gemessen und die Ergebnisse mithilfe eines Computerprogramms ausgewertet werden. Eine ELISA-Lesemaschine ist ein Spektrophotometer, das die Lichtabsorption von Flüssigkeiten in den Löchern misst.

II. Agglutination

In dem Praktikum führen Sie einen Agglutinationstest durch.

Es gibt verschiedene Latex Agglutinationstests in den Kisten auf den Tischen. Ziehen Sie sich Gummihandschuhe an. Sie arbeiten mit positiven und negativen Kontrollen, die den Tests hinzugefügt wurden.

  1. Träufeln Sie je einen Tropfen mit Latexkügelchen (Weiße/Blaue/Grüne Lösung) in die 2 Reaktionskreise (sehe unten Bild).
  2. Fügen sie einen Tropfen der positiven Kontrolle in den einen und einen Tropfen der negativen Kontrolle in den anderen Kreis hinzu.
  3. Vermischen sie die Kugeln und die Kontrollen, indem Sie die Oberfläche der Karten mit Stäbchen reiben.
  4. In der positiven Kontrolle sollte es zu einer sichtbaren Verklumpung kommen. Die Negativkontrolle bleibt milchig opaleszierend.