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Praktikum 4.: (Woche 27. Sept-1. Okt. 2021)

Direkte Immunhistochemie

Allgemeine Informationen:

Wir werden den theoretischen Hintergrund zur Immunhistologie im Praktikum 4 ausführlich diskutieren. Vorab geben wir die folgenden Instruktionen für den praktischen Teil zur Vorbereitung aus. Bitte lesen Sie diese aufmerksam vor dem Praktikum durch und befolgen Sie die beschriebenen Schritte.

Arbeitsschritte des Praktikums:

Während des Praktikums führen Sie eine immunhistochemische Färbung durch. Da Sie mit giftigen Chemikalien arbeiten müssen Sie einen Laborkittel und Gummihandschuhe tragen. Dieses Dokument fasst die Schritte des Praktikums zusammen.

1. Auf dem Objektträger befindet sich ein Schnitt einer Mausmilz. Isolierung, Gewebsschnitt und Fixierung der Mausmilz wurden bereits von unseren Kollegen durchgeführt.
2. Der erste Schritt ist die endogene Peroxidasehemmung mit Phenylhydrazin (Reagenzglas 1). Phenylhydrazin ist in PBS gelöst. Da Phenylhydrazin giftig ist, berühren Sie es nur mit Gummihandschuhen. Setzen Sie eine Pipettenspitze auf die Pipette und pipettieren Sie die Lösung vorsichtig. Die Lösungen sollten tropfenweise zum eingekreisten Schnitt hinzugefügt werden. Lassen Sie 100 ml Lösung mit der Pipette sehr vorsichtig auf den Schnitt tropfen. Da das Präparat leicht beschädigt werden kann, darf die Pipettenspitze den Schnitt dabei nicht berühren. Verwenden Sie für jeden Schritt eine neue Pipettenspitze. Werfen Sie gebrauchte Pipettenspitzen in das Glas ab. Die Inkubationszeit beträgt 10 Minuten.
3. Gießen Sie die Phenylhydrazinlösung vom Objektträger. Drehen Sie diesen dazu zur Seite und lassen Sie die Lösung in die Petrischale fließen. Wischen Sie die Flüssigkeit immer mit einem Papiertuch von der anderen Seite des Objektträgers ab. Achten Sie darauf, den Schnitt nicht versehentlich von dem Objektträger zu entfernen.
4. Waschen: Stecken Sie den Objektträger mit dem Schnitt in den „PBS-Behälter 1“ ein. Eine Inkubationszeit von 2 Minuten folgt. Nehmen Sie den Objektträger aus der PBS-Lösung. Gießen Sie das PBS wie zuvor von dem Objektträger. Wiederholen Sie den Waschvorgang (PBS-Behälter 2) wie zuvor. Weitere 2 Minuten Inkubation folgen.
5. Der nächste Schritt ist die Blockierung. In diesem Schritt werden unspezifische Proteinbindungsstellen mit 5% BSA-PBS-Lösung blockiert. Gießen Sie die PBS-Lösung von dem Schnitt und pipettieren Sie 100 ml BSA-PBS-Lösung (Reagenzglas 2) vorsichtig auf das Präparat. Es folgt eine 10-minütige Inkubation.
6. Im nächsten Schritt werden T-Zellen mit 100 ml monoklonalem Anti-Thy-1-Antikörper (Reagenzglas 3) markiert. Thy-1 ist ein T-Zell-Marker. Der Thy-1-spezifische Antikörper ist mit HRP konjugiert. Eine Inkubationszeit von 30 Minuten folgt.
7. Waschen: Der Objektträger wird auf bekannte Weise (siehe 4.) dreimal 2 Minuten lang in PBS gewaschen (in PBS-Behälter 2).
8. Der letzte Schritt ist die Zugabe von Chromogen und Substrat. Gießen Sie PBS von dem Objektträger. 100 ml Chromogen (DAB: Diamino-benzidine, GIFTIG) in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid (Substrat), gelöst in 0,1 M (molare) Tris-HCl-Puffer hinzufügen. In Anwesenheit des Substrats wandelt die antikörper-konjugierte HRP das Chromogen in ein farbiges Endprodukt um.
9. Das histologische Präparat wird im Mikroskop untersucht.

Liebe Studenten/Innen,

Wir möchten Sie auf einige wichtige Informationen über die Prüfung vom Fach "Grundlagen der Immunologie" aufmerksam zu machen:

1. Die Präsenzprüfungen werden im Hörsaal I-IV zu den Zeitpunkten gehalten, die im Neptun zu finden sind.
2. Studierende werden über Neptun darüber informiert, in welchem Hörsaal ihre Prüfung stattfindet. Die Liste den Studierenden wird in jedem Hörsaal auch an der Tür veröffentlicht.
3. Es ist obligatorisch, beim Betreten des Hörsaals und während der ganzen Prüfung einen Mund-und Nasenschutz zu tragen.
4. Die Prüfung wird in Form eines elektronisch generierten schriftlichen Tests auf der Website medtraining.eu abgewickelt.
5. Jede/r Studierende muss ein eigenes Laptop oder Tablet mitbringen, um auf der Website Medtraining einzuloggen (wir können kein Gerät sichern).
6. Die Prüfung kann ausschließlich auf einem Laptop oder Tablet gemacht werden. Handys sind in der Prüfung nicht erlaubt (bevor die Studierenden Platz nehmen, müssen sie alle die Handys abgeben). Auch die Inanspruchnahme eines Smartwatches ist nicht erlaubt.
7. Studierende müssen sicherstellen, dass ihre Geräte funktionieren und für die ganze Prüfung eine genügende Ladung haben (zirka 120 Min.). Ladungsmöglichkeiten werden nur limitiert erreichbar.
8. Studierende dürfen ausschließlich das WIFI-Netzwerk der Universität "eduroam" benutzen.
9. Beim Platznehmen müssen die Studierenden ihre Identität mit einem Ausweis nachweisen.
10. Während der Prüfung darf nur das Medtraining-System auf dem Laptop oder Tablet geöffnet werden; die Anwendung von anderen Apps oder Fenstern ist verboten und es führt zur sofortigen Beendung der Prüfung mit der Note 1.
11. Bevor die Studierenden den Test beenden, müssen sie ihre Hand heben, damit die Aufsicht sehen kann, dass sie/er die Prüfung abschließen möchte. In der Anwesenheit der Aufsicht (Laptop-oder Tablet-Bildschirm muss sichtbar gemacht werden) reicht die/der Studierende den Test im Medtraining (abgeschlossen) ein. Die Aufsicht schreibt das Ergebnis und den Zeitpunkt der Beendigung der Prüfung auf.  

Prof. Dr. Timea Berki

Dr. Ferenc Boldizsár

Liebe Studierende,

in dem Anhang kann man die wichtigsten Informationen zur Prüfung „Grundlagen der Immunologie” als pdf File finden. Bitte lesen Sie diese Informationen aufmerksam zur erfolgreichen und reibungslosen Abwicklung der Prüfung.

Diese Informationen sind auch im MS Teams erreichbar.

Mit freundlichen Grüßen

Professor Dr. Berki Timea                 Dr. Boldizsár Ferenc                    Dr. Fekete Szabolcs

Institutsleiterin                               ordentlicher Professor               medtraining Administrator

Universitätsprofessorin                   Unterrichtsbeauftragter          

Attachments:

Informationen_Online-Prüfung_Grundlagen Immunol_2020.12.04.pdf

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Praktikum 7. (Woche 19.-23. Okt. 2020)

Immunserologie

Allgemeine Informationen:

Wir haben den theoretischen Hintergrund zur Immunserologie im Praktikum 5 ausführlich diskutiert. Deshalb werden wir diese Informationen nicht wiederholen, bitte nutzen Sie die Folien des Praktikums der 5. Woche für Vorbereitung auf das kommende Praktikum. Die Dozenten von jeder Gruppe helfen bei diesem Praktikum und koordinieren die Arbeit, aber werden nicht den Stoff des Praktikums der 5. Woche wiederholen. Jeder Student muss vorbereitet kommen, so dass er/sie das folgende Praktikum selbstständig durchführen kann.

In den ersten 10 Minuten gibt es den Vorlesungtest auf Medtraining, diesen können Sie mit ihren Mobilgeräten beantworten. Am Ende des Praktikums gibt es dieses Mal keinen Praktikumstest in Medtraining.

Arbeitsschritte des Praktikums:

I. Indirekter ELISA

In dieser praktischen Beschreibung können Sie die Schritte des heutigen Praktikums sehen. Heute machen wir einen ELISA-Test. Auf jedem Tisch befindet sich ein ELISA-Kit. Ziehen Sie sich einen Laborkittel und Gummihandschuhe an.

1. Der erste Schritt ist die Sensibilisierung, bei der das Antigen an die Oberfläche der Mikrotiterplatten gebunden wird.
2. Der zweite Schritt ist die Blockierung, wobei unspezifische Bindungsstellen mit Gelatine blockiert werden. Diese beiden Schritte wurden vom Hersteller durchgeführt.
3. Der nächste Schritt ist das Hinzufügen von den zu untersuchenden Testproben und Standardkontrollen. Für die Demonstration arbeiten Sie nur mit den Standards (Calibrators).Die Mikrotiterplatte besteht aus einem Rahmen und einführbaren Streifen. Wir können so viele Streifen in den Rahmen passen, wie wir Proben haben. Die Kisten enthalten Flaschen mit der Aufschrift „Calibrator“. Die mit Calibrator gekennzeichneten Flaschen enthalten die antigenspezifischen humanen Antikörper  in einer bekannten Konzentration. „Calibrator A“ ist der am wenigsten konzentrierte Standard, „Calibrator F“ ist der höchste Standard. Das Kit enthält negative und positive Kontrollen sowie Gebrauchsanweisungen. Die Position der Löcher in den Streifen kann durch die Buchstaben und Zahlen auf dem Rahmen bestimmt werden. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Calibrator A ins Loch A1. Pipettieren Sie die anderen Calibratoren in die Löcher B1, C1 usw., und die positive Kontrolle ins Loch G1 und die negative Kontrolle ins Loch H1. Es folgt eine 30-minütige Inkubation. Während dieser Zeit machen Sie die Agglutination (sehe unten II.).

4. Waschen: Gießen Sie die Flüssigkeit mit einer Bewegung in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Platte gegen das Papiertuch. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in die Löcher. Gießen Sie dann den Puffer in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Mikrotiterplatte einmal auf das Papiertuch. Wiederholen Sie das Waschen dreimal.
5. Pipettieren Sie jetzt 100 Mikroliter Enzymkonjugatlösung (enthält Peroxidase konjugierte anti-human IgG Antikörper) in die Löcher. Es folgt eine 15-minütige Inkubation.
6. Waschen: Gießen Sie die Flüssigkeit mit einer Bewegung in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Platte gegen das Papiertuch. Pipettieren Sie 300 Mikroliter Waschpuffer in die Löcher. Gießen Sie dann den Puffer in den Plastikbehälter und klopfen Sie die Mikrotiterplatte einmal auf das Papiertuch. Wiederholen Sie das Waschen dreimal.
7. Pipettieren Sie 100 Mikroliter TMB Substrat in die Löcher. Sie sollten die Farbreaktion innerhalb von 5 Minuten sehen. Die Negativkontrolle sollte farblos sein, wenn der Test korrekt durchgeführt wurde. Die Farbintensität der Standards ist proportional zur Konzentration des Antigens. Stoppen Sie nach 5 Minuten die Reaktion mit 100 Mikrolitern „STOP“-Lösung. Wegen der STOP-Lösung wird die blaue Lösung gelb. Die ELISA-Platte kann dann in einer ELISA-Lesemaschine gemessen und die Ergebnisse mithilfe eines Computerprogramms ausgewertet werden. Eine ELISA-Lesemaschine ist ein Spektrophotometer, das die Lichtabsorption von Flüssigkeiten in den Löchern misst.

II. Agglutination

In dem Praktikum führen Sie einen Agglutinationstest durch.

Es gibt verschiedene Latex Agglutinationstests in den Kisten auf den Tischen. Ziehen Sie sich Gummihandschuhe an. Sie arbeiten mit positiven und negativen Kontrollen, die den Tests hinzugefügt wurden.

1. Träufeln Sie je einen Tropfen mit Latexkügelchen (Weiße/Blaue/Grüne Lösung) in die 2 Reaktionskreise (sehe unten Bild).
2. Fügen sie einen Tropfen der positiven Kontrolle in den einen und einen Tropfen der negativen Kontrolle in den anderen Kreis hinzu.
3. Vermischen sie die Kugeln und die Kontrollen, indem Sie die Oberfläche der Karten mit Stäbchen reiben.
4. In der positiven Kontrolle sollte es zu einer sichtbaren Verklumpung kommen. Die Negativkontrolle bleibt milchig opaleszierend.